方案如下：
作者的方案设计思路，值得大家借鉴：
1、将可固定的死活鉴别染料AViD与CD14V、CD19V放在一个通道，实现了排除性标记，排除死细胞、单核细胞、B细胞等的干扰。
2、Th1细胞因子对于调控结核菌很关键，所以加入了TNF和IFN-g抗体，作者将TNF标记设计为PE-cy7，因为FITC荧光偏弱，并且容易发生淬灭。
由于新型的BV系列染料亮度较高，据报道与PE相似，故作者准备将IFN-g抗体的荧光素改为BV，不过在实验过程中发现经过抗原特异性刺激后IFN-gBV的背景较高，排除掉背景后，反应水平与V相似，故最终定为IFN-gV。
3、IL-2在结核免疫时T细胞增殖和分化中都发挥着重要作用，所以用比较亮的PE标记。
4、由于结核分枝杆菌是胞内菌，细胞溶解活性是控制疾病所必需的。CDa（LAMP-1）是脱颗粒的标记物和细胞溶解功能的标记物。理想情况下，CDa可以和Perforin等细胞毒蛋白共染来证实细胞毒能力，但是目前这个方案数量有限，所以暂时只能增加这一个。为了与TNF荧光素更改匹配，作者将CDa移至FITC，但后来发现用AlexaFluor（Ax）更强、更稳定，故改用Ax。
5、CCR7负责将T细胞归巢到淋巴结，并在中央记忆T细胞（TCM）上表达。CD45RO是CD45的最小同种亚型，会表达在效应记忆（TEM）和TCM上。两个标记共染，可以区分出初始、TCM、TEM或效应T细胞。作者为CCR7选择了BrilliantViolet，因为它是最亮的BrilliantViolet染料，而CCR7的表达分群不清楚，呈现为连续性表达。当在37℃下孵育时，CCR7抗体的结合动力学显示出最佳染色。基于抗体可用性和与其他标记物的最小光谱重叠，选择了用于CD45RO的BrilliantViolet。
6、IL-17A由Th17细胞分泌，并用于将先天免疫效应细胞募集到炎症部位。最近的文献认为IL-17A在结核病免疫中有着强大作用。因此，作者用抗IL-17A抗体代替了OMIP-中的MIP-1b抗体。预实验时，CD8PerCP-Cy5.5与IL-17AAx之间重叠明显，由于IL-17A与CD8相比表达强度更低，而PerCP-Cy5.5荧光较亮，所以作者将CD8改为Ax，而IL-17A改为PerCP-Cy5.5。
不过CD8改为Ax后，CD8＋事件减少了，据推测可能是escapee现象，所以作者将CD8改为胞内染色。
7、以前包含在OMIP-中的IL-4是代表性的Th2细胞因子。这种白细胞介素是非常难以检测的，很难得到一致的结果。因此作者用IL-22APC代替了IL-4。IL-22是IL-10超家族的一部分，当与IL-17共同表达时，增加粘膜中的抗菌肽的生产。
8、CD在本方案中保留，因为新的证据表明该标记是检测CD4反应的特异性和敏感性标记物，并且其在上调抗微生物肽和对B细胞活化中也非常重要。
最后，方案搭配好了，检测吧。结果图片分析如下，其中的前几步设门需要大家多
